凝胶迁移实验（EMSA）_EMSA

(1)实验前准备。包括纯化重组蛋白及合成DNA探针。(2)标记探针。在合成的DNA探针上标记放射性同位素32P或生物素。由于生物素不具有放射性以及便于操作等优点,近年来人们常使用生物素标记DNA探针。按照以下顺序配制标记组和竞争组的反应体系。标记组:12.5μL超纯水,5μL5×TdT缓冲液,2.5μL1μmol∙L–1未标记的Oligo,2.5μL5μmol∙L–1Biotin-11-UTP,2.5μL2U∙μL–1DilutedTdT。竞争组:20μL超纯水,2.5μL10×结合缓冲液(含Mg2),2.5μL50μmol∙L–1未标记的Oligo。37°C避光孵育30分钟。加入1.25μL0.2mol∙L–1EDTA终止反应,然后加入25μL氯仿:异戊醇(1:1),旋涡振荡混匀,16000×g离心1–2分钟,取上清。随后转移至90°C孵育2分钟,缓慢降温至60°C,最后于60°C孵育30分钟。(3)6%TBE凝胶制备及预电泳。按照配方依次加入各成分并充分混匀,注意在灌胶过程中要防止气泡的产生。待TBE凝胶完全凝固后开始预电泳,90V电泳1–2小时,电泳缓冲液为0.5×TBE缓冲液。(4)蛋白与探针结合反应。按照以下配方配制结合反应体系。实验组:50ng融合蛋白,0.5–2μL标记探针,6μL结合反应缓冲液,用超纯水定容至20μL。竞争组:50ng融合蛋白,0.5–2μL标记探针,过量的野生型未标记探针或突变型未标记探针,6μL结合反应缓冲液,用超纯水定容至20μL。其中,结合缓冲液的配方为:2μL10×结合缓冲液,1μL50%丙三醇,1μL100mmol∙L–1MgCl2,1μL1μg∙μL–1PolydI:dC,1μL1%NP-40。通常未标记野生型或突变型探针的用量为标记探针的10倍、50倍和100倍。PolydI:dC可抑制蛋白与DNA的非特异性结合,避免形成假复合物。(5)电泳。结合反应完毕后加入5μL上样缓冲液,充分混匀再进行上样。电压90V,待指示剂到达胶的3/4处时即可停止电泳。(6)转膜。将尼龙膜小心取出,放入0.5×TBE转膜缓冲液中,依次按照黑面-纤维垫-2层滤纸-胶-尼龙膜-2层滤纸-纤维垫-白面的顺序放置,注意不要有气泡产生。380mA工作60分钟。(7)紫外交联。取出尼龙膜用吸水纸吸干水,蛋白面朝下放入紫外交联仪中,紫外交联15分钟。(8)发光检测。将紫外交联后的尼龙膜置于干净的平皿中,加入10mL封闭缓冲液,轻柔摇动15分钟。轻轻倒掉封闭缓冲液,加入8mL结合/封闭缓冲液,轻柔摇动15分钟。将尼龙膜转移至新的平皿中,加入10mL1×漂洗液,轻柔漂洗5分钟,重复漂洗3次。将尼龙膜转移至新的平皿中,加入15mL底物平衡缓冲液,轻柔摇动15分钟。取出尼龙膜,吸干多余的底物平衡缓冲液,置于新的平皿中。加入6mL化学发光底物至完全覆盖尼龙膜,静置孵育5分钟。最后,取出尼龙膜,从侧面吸干多余的化学发光底物,用保鲜膜包被,在化学发光成像系统(Bio-step)中曝光5分钟进行显影。(9)数据分析。通常情况下,可以从两方面分析EMSA数据,即底部的自由探针和位于上方的迁移条带(蛋白-DNA复合物)。在加入等量标记探针的前提下,当蛋白与DNA产生互作时,底部的自由探针减少,迁移条带亮度增强。在此基础上增加未标记野生型探针会与标记探针竞争蛋白,此时自由探针条带强度基本不变,迁移条带亮度减弱;而当增加未标记的突变探针时,由于蛋白不结合该序列,突变探针不与标记探针竞争,此时自由探针减少,迁移条带亮度增强(Jiangetal.,2016)。