酵母单杂交文库

Invitrogen核/膜系统一、实验原理：真核生物基因的转录起始需转录因子参与，转录因子通常由DNA结合结构域(DNA—bindingdomain，BD)和转录激活结构域(activationdomain，AD)。用于酵母单杂交系统的酵母GAL4蛋白是一种典型的转录因子，GAL4的DNA结合结构域靠近羧基端，含有几个锌指结构，可激活酵母半乳糖苷酶的上游激活位点(UAS)，而转录激活结构域可与RNA聚合酶或转录因子TFIID相互作用，提高RNA聚合酶的活性。在这一过程中，DNA结合结构域和转录激活结构域可完全独立地发挥作用。在GAL4系统中构建与基因的ORFs融合的激活结构域GAL4-AD的特异载体，顺式作用元件与GAL4的DNA结合结构域GAL4-BD融合构建载体，分别转化酵母细胞。在酵母内表达的蛋白若与顺式作用元件发生相互作用时，就会将GAL4-BD和GAL4-AD结合在一起，从而与上游激活序列(upstreamactivatingsequence,UAS)结合，激活相应报告基因的表达，在相应的营养缺陷型培养基上筛选阳性。基因转录实际上是转录调控因子和启动子区各种顺式作用元件相互作用的结果，这种结合犹如蛋白质与蛋白质的互作一样具有特异性，这是研究顺式作用元件即DNA序列与蛋白质互作的基础。二、实验步骤：1.1RNA提取1.2mRNA分离1.3cDNA初级文库的构建1.3.1cDNA第一链的合成1.3.2cDNA第二链的合成1.3.3cDNAadapter的制备1.3.4cDNA与attB1重组接头连接(三份接头各连一份)1.3.5cDNA分级分离1.3.6BP重组1.3.7电转化大肠杆菌DH10B1.3.8文库克隆检测1.3.9文库库容量、重组率、插入片段长度鉴定1.4cDNA次级文库的构建1.4.1初级文库的质粒抽提1.4.2LR重组1.4.3电转化大肠杆菌DH10B1.4.4文库克隆检测1.4.5文库库容量、重组率、插入片段长度鉴定三、实验结果：次级文库库容大于107，重组率大于90%，平均插入片段大于1kb。

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