酵母双杂交文库

Invitrogen核/膜系统一、实验原理：酵母双杂交系统是在酵母体内通过重建有活性转录因子的结构来鉴定蛋白质之间的相互作用。转录因子可以和DNA上特异的序列结合而启动相应基因的转录。这种DNA结合与转录激活的功能是由转录因子上两个相互独立的结构域即DNA结合结构域(BindingDomain,BD)和转录激活结构域(ActivationDomain,AD)分别来完成的，并且这两个结构域对于基因的转录激活都是必须的。在GAL4系统中利用转录因子GAL4的DNA结合结构域GAL4-BD与激活结构域GAL4-AD的特异载体，分别与基因的ORFs融合，转化酵母细胞。在酵母内表达的蛋白若发生相互作用时，就会将GAL4-BD和GAL4-AD结合在一起，从而与上游激活序列(upstreamactivatingsequence,UAS)结合，激活相应报告基因的表达，在相应的营养缺陷型培养基上筛选阳性。酵母双杂交文库的构建是筛库的前提，可用于目的蛋白的互作蛋白大规模筛选分析蛋白质间的相互作用，是现在分子生物学与生物化学常用的手段。二、实验步骤：1.1RNA提取1.2mRNA分离1.3cDNA初级文库的构建1.3.1cDNA第一链的合成1.3.2cDNA第二链的合成1.3.3cDNAadapter的制备1.3.4cDNA与attB1重组接头连接(三份接头各连一份)1.3.5cDNA分级分离1.3.6BP重组1.3.7电转化大肠杆菌DH10B1.3.8文库克隆检测1.3.9文库库容量、重组率、插入片段长度鉴定1.4cDNA次级文库的构建1.4.1初级文库的质粒抽提1.4.2LR重组1.4.3电转化大肠杆菌DH10B1.4.4文库克隆检测1.4.5文库库容量、重组率、插入片段长度鉴定三、实验结果：次级文库库容大于107，重组率大于90%，平均插入片段大于1kb。

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