西北GST-pull down_西安GST-pull down实验

　　将过夜培养的3ml菌液接入300ml（1:100）含有抗生素的LB液体培养基中，37度，200转，5-3h，摇至OD600=0.8左右。取出0！5ml菌液于4度保存作为诱导前菌液!同时在剩余菌液中加入终浓度为1mM/L的IPTG，16-27度，100-200转，诱导8-16h。诱导后取出0!5mL菌液于4°C保存作为诱导后菌液;4°C,6000rpm,离心15分钟,收集诱导后菌体,用20mLPBS溶液重悬菌体后,转移至50mL离心管中;4°C,6000rpm,10分钟,倒掉上清,液氮速冻,–80°C保存用于纯化;4°C,10000rpm,2分钟,收集诱导前菌液和诱导后菌液,用80μL1XSDS上样缓冲液重悬菌体;（10）100°C,煮沸样品5分钟,12000rpm,离心2分钟,取上清对诱导结果进行SDS-PAGE检测。

西北GST-pull down

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　　在Pull-down实验中,设计恰当的对照实验非常重要,该对照可以是表达有GST(非诱饵融合蛋白)的转化细胞裂解物,也可以是将GST加到非转化细胞的裂解物中!GST融合蛋白Pull-down的方法可以用来鉴定能与已知融合蛋白相互作用的未知蛋白质,也可以鉴定2个已知蛋白质之间是否存在相互作用！此方法简单易行,操作方便！但Pull-down的结果并不能真实的反应蛋白质之间的相互作用,因为在活体内它们不一定在亚细胞空间上能碰到,所以并不意味着在生理条件下一定结合.

　　 西安淳风生物科技有限公司在其他生物制品这个行业中，是一家屈指可数的好公司。其主营的产品——蛋白质体外结合实验（GST pull-down 技术），更是在业界中受到广大客户的喜爱。

　　C!孵育蛋白：将GST融合蛋白裂解液加入洗涤后的GST-sepharosebeads中。4℃震荡孵育1小时。D。收集beads:5000rpm离心30秒，两次，沉淀beads。E！清洗beads:吸出上清，用1mLBC500缓冲液（含1%TritonX-100，不含蛋白酶抑制剂）清洗beads3次！5000rpm离心30秒，两次，沉淀beads!F。清洗beads:以1mLBC100缓冲液（含0.1%TritonX-100，不含蛋白酶抑制剂）清洗beads3次。

　　B。吸出上清!以1mLBC100缓冲液（含0！1%TritonX-100）清洗beads3次.C.加入1xloadingbuffer50µL，连同input样本，95℃金属浴5min。离心分离beads，取上清进行Westernblot检测!将表达GST融合蛋白（实验组）和GST（对照组）的质粒分别转入BL21菌株中。分别挑取阳性单克隆于3ml含有抗生素的LB液体培养基中，37度，200转，过夜培养。

　　C.在磁珠中加入400µLElutionbuffer，室温震荡2分钟，磁性分离收集洗液.反复3次.D!将3次中收集到的液体用10K的超滤管进行浓缩，5000g，离心15分钟，加入500µLBC100缓冲液进行缓冲液置换，5000g，离心15分钟，收集到50-100µL浓缩蛋白。蛋白结合及检测：A！纯化蛋白结合：向GST及GST-DNMT3Lbeads中分别加入10µLHis-USP46纯化蛋白，4℃震荡孵育1小时，5000rpm离心30秒，两次，沉淀beads.自中国东盟自贸区建立后，双边贸易取得了长足发展，根据海关数据显示，中国与东盟的互补性贸易将极大丰富双边国内市场，东盟的广阔市场也愈发凸现其重要意义。为抓住中国东盟自由贸易区建成契机，用好用足东盟优惠政策，帮助更多中小企业开拓东盟市场。以泰国为首的东盟贸易伙伴为满足根据两国产业差异，大力发展产业互补性展会。如，10月在广西举行的第七届中国—东盟博览会。本次展会，我市就有5家涉及太阳能、家用电器、建筑建材类企业最终获得了8个展位。有企业反应，为专门针对东盟市场特地带去了低端的建筑材料塑料制品受到了越南、俄罗斯客商的欢迎。