西北Co-IP实验外包 Co-IP

　　5ml/5x106个细胞、6cm培养皿、75cm2培养瓶）!用预冷的细胞刮子将细胞从培养皿或培养瓶上刮下，把悬液转到5EP管中，4℃，缓慢晃动15min（EP管插冰上，置水平摇床上）。4℃，14000g离心15min，立即将上清转移到一个新的离心管中!准备ProteinAagarose，用PBS洗两遍珠子，然后用PBS配制成50%浓度，建议减掉枪尖部分，避免在涉及琼脂糖珠的操作中破坏琼脂糖珠!每1ml总蛋白中加入100ulProteinA琼脂糖珠（50%），4℃摇晃10min（EP管插冰上，置水平摇床上），以去除非特异性杂蛋白，降低背景。

　　目前多用精制的proreinA预先结合固化在argarose的beads上，使之与含有抗原的溶液及抗体反应后，beads上的proreinA就能吸附抗原达到精制的目的!这种方法常用于测定两种目标蛋白质是否在体内结合；也可用于确定一种特定蛋白质的新的作用搭档.试剂准备预冷PBS，RIPABuffer，细胞刮子（用保鲜膜包好后，埋冰下），离心机!用预冷的PBS洗涤细胞两次，一次吸干PBS！加入预冷的RIPABuffer(1ml/107个细胞、10cm培养皿或150cm2培养瓶，0.

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　　将收集的肽在ABI477A或494A机器上进行自动Edman降解测序！注意事项：细胞裂解采用温和的裂解条件，不能破坏细胞内存在的所有蛋白质——蛋白质相互作用，多采用非离子变性剂（NP40或TritonX-100）。每种细胞的裂解条件是不一样的，通过经验确定!不能用高浓度的变性剂（0.2％SDS），细胞裂解液中要加各种酶抑制剂，如商品化的!使用明确的抗体，可以将几种抗体共同使用！使用对照抗体：单克隆抗体：正常小鼠的IgG或另一类单抗兔多克隆抗体：正常兔IgG确保共沉淀的蛋白是由所加入的抗体沉淀得到的，而并非外源非特异蛋白，单克隆抗体的使用有助于避免污染的发生。

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　　实验原理：免疫共沉淀（Co-immunoprecipitation,Co-IP）以抗体和抗原之间的专一性作用为基础，用于研究两个蛋白质在活体细胞内生理性相互作用的经典的方法.当活体细胞在非变性条件下被裂解时，完整细胞内存在的许多蛋白质-蛋白质间的相互作用被保留下来.如果用蛋白质X的抗体免疫沉淀X，与X在细胞内结合的蛋白质Y可以与蛋白质X一起以复合物的形式被沉淀下来，然后经Westernblot或质谱的方法对蛋白质Y进行检测或鉴定!

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　　实验目的：确定两种目标蛋白质是否在活体细胞体内相互作用，也可用于确定一种特定蛋白质的新的相互作用搭档。操作步骤：适用范围依据抗体类型（蛋白质X自身特异性抗体、蛋白质X融合商品化标签抗体）！本方法试例举：蛋白质X融合FLAG标签，将该载体转基因转入水稻获得稳定转基因植株，然后用FLAG标签抗体利用Co-IP方法沉淀与蛋白质X互作的蛋白质复合物，用Westernblot方法检测蛋白质Y是否一起被沉淀下来，以确定在水稻体内蛋白质X和蛋白质Y是否真正相互作用.