材料与试剂携带表达载体的农杆菌菌株，2-4周的烟草植株，LB培养基，100mM乙酰丁香酮，0.5MMES（ph6），10mMMgCl2，恒温摇床，一次性注射器，分光光度计，Amp抗生素实验步骤挑取单克隆于1mlLB液体培养中，28~30°C震荡培养24小时!通常，LB中加入100ug/ml利福平（农杆菌株GV3101携带抗性），200ug/ml卡那霉素（载体携带）.将1ml过夜培养的农杆菌转接到25mlLB液体培养基中（加有与1相同的抗生素）.
基本原理在验证植物蛋白互作时，荧光素酶互补实验(LuciferaseComplementationAssay,LCA)因其高灵敏度、可定量化、操作简单高效被广泛应用于植物学和动物学蛋白质互作研究目前,应用广泛的荧火素酶基因来源于北美萤火虫(fireflyluciferase),该基因编码550个氨基酸组成的荧火素酶蛋白(大小为62kDa)!实验中,荧光素酶蛋白被切成N端和C端2个功能片段,即NLuc(2–416AA)和CLuc(398–550AA)！
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在一个实验体系中,待检测的2个目标蛋白分别与NLuc和CLuc融合,如果2个目标蛋白相互作用,则荧火素酶的NLuc和CLuc在空间上会足够靠近并正确组装,从而发挥荧火素酶活性,即分解底物产生荧光！Abstract:Protein-Proteininteractionsplayimportantrolesinvariouseukaryoticbiologicalprocesses。Comparedtoothertechniquesmeasuringprotein-proteininteractionsinplants,theLuciferaseComplementationAssay(LCA),basedonAgrobacterium-mediatedtransientexpressioninNicotianabenthamiana,isasensitive,reliable,highlyquantitativeandlowbackgroundmethodthatcanbeeasilyscaledupforhigh-throughputinteractomestudies！
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因为本实验为验证实验，注射前需将组合农杆菌进行混合!注射后72小时，取样通过荧光素酶检测试剂盒检测荧光信号.试剂:原生质体转化相关试剂（参阅拟南芥或者水稻原生质体转化相关章节）萤火虫荧光素酶底物（Promega,LuciferaseAssaySystem）实验过程将含有融合蛋白的植物表达载体转化农杆菌(Agrobacterium)后注射烟草叶片。24–48小时后，加入反应底物荧火素,利用植物活体分子影像系统(CCDimagingsystem)或luminometer来定性定量检测荧光强度,以判定目标蛋白之间是否存在相互作用及互作的程度！
另外加入2ul100mM的乙酰丁香酮和100ul0。5MMES，28度摇床培养OD值约0左右！4000rpm常温离心10min，15分钟收集菌体。用含10mMMgCl2重悬菌体至OD值为0，以每毫升菌液加入2ul100mMAS，静置3小时以上。取正处于生长期的烟草叶片，使用针头在叶片反面扎些小孔。将侵染液装入5ml注射器内，用拇指按压注射器反板将液体从叶片下表皮注射到烟草叶片内！注射后，烟草叶片会出现湿润的现象!
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