实验目的：检测蛋白质之间的体内相互作用。操作步骤：载体构建：将两个蛋白质分别与M-NLUC和M-CLUC融合连接！抽提质粒。农杆菌转化.侵染烟草，测量发出荧光的信号值并拍照，计算荧光素酶相对活性，判断蛋白质之间是否互作。注意事项：本实验必须要设计严谨的对照！连有目的基因的载体必须分别和另外一个空载体共转化，同时需要两个空载体之间共转化，以排除背景信号的影响。同时可以转化一对确定互作的蛋白质来评价系统的有效性。
另外加入2ul100mM的乙酰丁香酮和100ul0!5MMES，28度摇床培养OD值约0左右.4000rpm常温离心10min，15分钟收集菌体.用含10mMMgCl2重悬菌体至OD值为0，以每毫升菌液加入2ul100mMAS，静置3小时以上!取正处于生长期的烟草叶片，使用针头在叶片反面扎些小孔！将侵染液装入5ml注射器内，用拇指按压注射器反板将液体从叶片下表皮注射到烟草叶片内！注射后，烟草叶片会出现湿润的现象!
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因为本实验为验证实验，注射前需将组合农杆菌进行混合。注射后72小时，取样通过荧光素酶检测试剂盒检测荧光信号.试剂:原生质体转化相关试剂（参阅拟南芥或者水稻原生质体转化相关章节）萤火虫荧光素酶底物（Promega,LuciferaseAssaySystem）实验过程将含有融合蛋白的植物表达载体转化农杆菌(Agrobacterium)后注射烟草叶片.24–48小时后，加入反应底物荧火素,利用植物活体分子影像系统(CCDimagingsystem)或luminometer来定性定量检测荧光强度,以判定目标蛋白之间是否存在相互作用及互作的程度.
材料与试剂携带表达载体的农杆菌菌株，2-4周的烟草植株，LB培养基，100mM乙酰丁香酮，0！5MMES（ph6），10mMMgCl2，恒温摇床，一次性注射器，分光光度计，Amp抗生素实验步骤挑取单克隆于1mlLB液体培养中，28~30°C震荡培养24小时!通常，LB中加入100ug/ml利福平（农杆菌株GV3101携带抗性），200ug/ml卡那霉素（载体携带）.将1ml过夜培养的农杆菌转接到25mlLB液体培养基中（加有与1相同的抗生素）!
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在一个实验体系中,待检测的2个目标蛋白分别与NLuc和CLuc融合,如果2个目标蛋白相互作用,则荧火素酶的NLuc和CLuc在空间上会足够靠近并正确组装,从而发挥荧火素酶活性,即分解底物产生荧光!Abstract:Protein-Proteininteractionsplayimportantrolesinvariouseukaryoticbiologicalprocesses。Comparedtoothertechniquesmeasuringprotein-proteininteractionsinplants,theLuciferaseComplementationAssay(LCA),basedonAgrobacterium-mediatedtransientexpressioninNicotianabenthamiana,isasensitive,reliable,highlyquantitativeandlowbackgroundmethodthatcanbeeasilyscaledupforhigh-throughputinteractomestudies。
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