上海Co-IP公司 西安Co-IP

　　于4°C，12,000rpm离心15s，小心将上清吸取弃之！加入约40µl2倍上样缓冲液，100°C变性5min，稍离心，取适量体积进行Westernblot实验，分别用商品化FLAG标签抗体和蛋白质Y抗体进行检测!通过免疫共沉淀确定结合蛋白1．用磷酸盐缓冲液洗30块10cm培养板上的适宜细胞！刮去每块板上的细胞到1ml冰冷的EBC裂解缓冲液中；2．将每毫升细胞悬液转移到微量离心管中，在微量离心机上4℃离心15；3．收集上清（约30ml）并加入30ug的适当抗体，4℃摇动免疫沉淀物1h；4．加入0。

　　加入20倍体积预冷的TBS缓冲液以平衡Gel，于4°C，4,000rpm离心1min，小心将上清吸取弃之；重复3次!于4°C，12,000rpm离心15s，小心将上清吸取弃之。取蛋白质加入到已平衡化的Anti-FLAGM2AffinityGel中，于4°C孵育。洗脱Gel.于4°C，4,000rpm离心1min，小心将上清吸取弃之！加入1,500µl预冷的IP缓冲液洗脱Gel，于4°C孵育5min，4,000rpm离心1min，小心将上清吸取弃之；如此重复3次.

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　　取水稻叶片5g，经液氮研磨后，加入3倍体积蛋白IP缓冲液，在4°C混匀30min！于4°C，12,000g离心30min，将上清转移至一个预冷的新的离心管中.用0.22µm滤膜过滤上清，取过滤的50µl上清作为Input，用于蛋白质X的检测!Anti-FLAGM2AffinityGel预处理！取出50µl预混匀的Anti-FLAGM2AffinityGel转移至一预冷的离心管中!于4°C，4,000rpm离心1min，小心将上清吸取弃之。

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　　实验原理：免疫共沉淀（Co-immunoprecipitation,Co-IP）以抗体和抗原之间的专一性作用为基础，用于研究两个蛋白质在活体细胞内生理性相互作用的经典的方法.当活体细胞在非变性条件下被裂解时，完整细胞内存在的许多蛋白质-蛋白质间的相互作用被保留下来！如果用蛋白质X的抗体免疫沉淀X，与X在细胞内结合的蛋白质Y可以与蛋白质X一起以复合物的形式被沉淀下来，然后经Westernblot或质谱的方法对蛋白质Y进行检测或鉴定！

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　　4℃，14000g离心15min，将上清转移到一个新的离心管中，去除ProteinA珠子。9．（Bradford法）做蛋白标准曲线，测定蛋白浓度，测前将总蛋白至少稀释1：10倍以上，以减少细胞裂解液中去垢剂的影响（定量，分装后，可以在-20℃保存一个月）。10.用PBS将总蛋白稀释到约1ug/ul，以降低裂解液中去垢剂的浓度，如果兴趣蛋白在细胞中含量较低，则总蛋白浓度应该稍高（如10ug/ul）!1加入一定体积的兔抗到500ul总蛋白中，抗体的稀释比例因兴趣蛋白在不同细胞系中的多少而异!

　　 如果您想了解Co-IP更多信息，请致电 :17791388172，或者您直接到我们公司总部一起交流研讨，地址：陕西省西安市雁塔区长安南路86号澳城大厦，我们期待您的致电或来访。

　　9ml的蛋白质A-Sepharose悬液，4℃摇动免疫沉淀物30min；5．用含900mmol/LNaCl的NETN洗蛋白A-Sepharose混合物，再重复洗5次.用NETN洗一次；6．吸出混合物的液体部分！加入800ul的1xSDS胶加样缓冲液到球珠中，煮沸4min；7．将样品加入到大孔的不连续SDS-PAGE梯度胶中，在10mA的恒定电流下电泳过夜；8．通过考马斯亮蓝染色观察蛋白质泳带；9．从胶上切下目标带，将其放到微量离心管中，用1ml50%乙腈洗两次，每次3min；10．用胰蛋白酶消化胶中的蛋白质，再将肽电洗脱；11．通过窄孔高效液相色谱分离肽。