贵阳Co-IP实验 贵阳Co-IP

　　于4°C，12,000rpm离心15s，小心将上清吸取弃之！加入约40µl2倍上样缓冲液，100°C变性5min，稍离心，取适量体积进行Westernblot实验，分别用商品化FLAG标签抗体和蛋白质Y抗体进行检测.通过免疫共沉淀确定结合蛋白1．用磷酸盐缓冲液洗30块10cm培养板上的适宜细胞.刮去每块板上的细胞到1ml冰冷的EBC裂解缓冲液中；2．将每毫升细胞悬液转移到微量离心管中，在微量离心机上4℃离心15；3．收集上清（约30ml）并加入30ug的适当抗体，4℃摇动免疫沉淀物1h；4．加入0！

正宗贵阳Co-IP

　　1用60ul2x上样缓冲液将琼脂糖珠-抗原抗体复合物悬起，轻轻混匀，缓冲液的量依据上样多少的需要而定（60ul足够上三道）！1将上样样品煮5min，以游离抗原，抗体，珠子，离心，将上清电泳，收集剩余琼脂糖珠，上清也可以暂时冻-20℃，留待以后电泳，电泳前应再次煮5min变性.免疫共沉淀反应1．转染后24-48h可收获细胞，加入适量细胞裂解缓冲液（含蛋白酶抑制剂），冰上裂解30min,细胞裂解液于4°C，离心30min后取上清；2．取少量裂解液以备Westernblot分析，剩余裂解液加1ug相应的抗体加入到细胞裂解液，4°C缓慢摇晃孵育过夜；3．取10ulproteinA琼脂糖珠，用适量裂解缓冲液洗3次，每次3000rpm离心3min；．将预处理过的10ulproteinA琼脂糖珠加入到和抗体孵育过夜的细胞裂解液中4°C缓慢摇晃孵育2-4h，使抗体与proteinA琼脂糖珠偶连；5．免疫沉淀反应后，在4°C以3000rpm速度离心3min，将琼脂糖珠离心至管底；将上清小心吸去，琼脂糖珠用1ml裂解缓冲液洗3－4次；加入15ul的2xSDS上样缓冲液，沸水煮5分钟；6．SDS-PAGE，Westernblotting或质谱仪分析.

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　　5ml/5x106个细胞、6cm培养皿、75cm2培养瓶）！用预冷的细胞刮子将细胞从培养皿或培养瓶上刮下，把悬液转到5EP管中，4℃，缓慢晃动15min（EP管插冰上，置水平摇床上）。4℃，14000g离心15min，立即将上清转移到一个新的离心管中。准备ProteinAagarose，用PBS洗两遍珠子，然后用PBS配制成50%浓度，建议减掉枪尖部分，避免在涉及琼脂糖珠的操作中破坏琼脂糖珠！每1ml总蛋白中加入100ulProteinA琼脂糖珠（50%），4℃摇晃10min（EP管插冰上，置水平摇床上），以去除非特异性杂蛋白，降低背景！

　　9ml的蛋白质A-Sepharose悬液，4℃摇动免疫沉淀物30min；5．用含900mmol/LNaCl的NETN洗蛋白A-Sepharose混合物，再重复洗5次!用NETN洗一次；6．吸出混合物的液体部分!加入800ul的1xSDS胶加样缓冲液到球珠中，煮沸4min；7．将样品加入到大孔的不连续SDS-PAGE梯度胶中，在10mA的恒定电流下电泳过夜；8．通过考马斯亮蓝染色观察蛋白质泳带；9．从胶上切下目标带，将其放到微量离心管中，用1ml50%乙腈洗两次，每次3min；10．用胰蛋白酶消化胶中的蛋白质，再将肽电洗脱；11．通过窄孔高效液相色谱分离肽！

　　14℃缓慢摇动抗原抗体混合物过夜或室温2h，激酶活性分析建议用2h室温孵育！1加入100ulProteinA琼脂糖珠来捕捉抗原抗体复合物，4℃缓慢摇动抗原抗体混合物过夜或室温1h，如果所用抗体为鼠抗或鸡抗，建议加2ul"过渡抗体"（兔抗鼠IgG，兔抗鸡IgG）。114000rpm瞬时离心5s，收集琼脂糖珠-抗原抗体复合物，去上清，用预冷的RIPAbuffer洗3遍，800ul/遍，RIPAbuffer有时候会破坏琼脂糖珠-抗原抗体复合物内部的结合，可以使用PBS!