西宁荧光素酶互补实验 荧光素酶互补

　　实验目的：检测蛋白质之间的体内相互作用！操作步骤：载体构建：将两个蛋白质分别与M-NLUC和M-CLUC融合连接。抽提质粒!农杆菌转化。侵染烟草，测量发出荧光的信号值并拍照，计算荧光素酶相对活性，判断蛋白质之间是否互作!注意事项：本实验必须要设计严谨的对照！连有目的基因的载体必须分别和另外一个空载体共转化，同时需要两个空载体之间共转化，以排除背景信号的影响！同时可以转化一对确定互作的蛋白质来评价系统的有效性!

　　材料与试剂携带表达载体的农杆菌菌株，2-4周的烟草植株，LB培养基，100mM乙酰丁香酮，0。5MMES（ph6），10mMMgCl2，恒温摇床，一次性注射器，分光光度计，Amp抗生素实验步骤挑取单克隆于1mlLB液体培养中，28~30°C震荡培养24小时.通常，LB中加入100ug/ml利福平（农杆菌株GV3101携带抗性），200ug/ml卡那霉素（载体携带）.将1ml过夜培养的农杆菌转接到25mlLB液体培养基中（加有与1相同的抗生素）!

　　在一个实验体系中,待检测的2个目标蛋白分别与NLuc和CLuc融合,如果2个目标蛋白相互作用,则荧火素酶的NLuc和CLuc在空间上会足够靠近并正确组装,从而发挥荧火素酶活性,即分解底物产生荧光。Abstract:Protein-Proteininteractionsplayimportantrolesinvariouseukaryoticbiologicalprocesses。Comparedtoothertechniquesmeasuringprotein-proteininteractionsinplants,theLuciferaseComplementationAssay(LCA),basedonAgrobacterium-mediatedtransientexpressioninNicotianabenthamiana,isasensitive,reliable,highlyquantitativeandlowbackgroundmethodthatcanbeeasilyscaledupforhigh-throughputinteractomestudies。

荧光素酶互补

　　另外加入2ul100mM的乙酰丁香酮和100ul0!5MMES，28度摇床培养OD值约0左右。4000rpm常温离心10min，15分钟收集菌体!用含10mMMgCl2重悬菌体至OD值为0，以每毫升菌液加入2ul100mMAS，静置3小时以上.取正处于生长期的烟草叶片，使用针头在叶片反面扎些小孔.将侵染液装入5ml注射器内，用拇指按压注射器反板将液体从叶片下表皮注射到烟草叶片内.注射后，烟草叶片会出现湿润的现象。

正宗荧光素酶互补

　　因为本实验为验证实验，注射前需将组合农杆菌进行混合!注射后72小时，取样通过荧光素酶检测试剂盒检测荧光信号！试剂:原生质体转化相关试剂（参阅拟南芥或者水稻原生质体转化相关章节）萤火虫荧光素酶底物（Promega,LuciferaseAssaySystem）实验过程将含有融合蛋白的植物表达载体转化农杆菌(Agrobacterium)后注射烟草叶片.24–48小时后，加入反应底物荧火素,利用植物活体分子影像系统(CCDimagingsystem)或luminometer来定性定量检测荧光强度,以判定目标蛋白之间是否存在相互作用及互作的程度！

　　Here,wedescribeaprotocolthatincludestwoalternativedatacollectionmethodstoqualitativeandquantitativeanalyseluminescenceorluminousintensitytodetectprotein-proteininteractionsinplantcells。原理利用农杆菌将外源基因导入烟草叶片中进行表达，可以借此进行蛋白的亚细胞定位、蛋白互作和蛋白纯化等实验操作! “B8502”采用了集测试功能成于一枚芯片的IC。由此，在可将4736个信号引脚和256个电源收纳在约1.0m3容积内的同时，还将耗电量降至4kVA。这样，在削减了设备投资和运行成本的情况下，还能够同时测量256个芯片。试验频率为66MHz，价格为7000万日元以上。“B8502ES”是用于“B8502”的工程师站。采用了使用了同一测试模块的PIN卡，并且使用了相同构造的插板。其结果，对从调试到量产能够提供相同的操作环境，无需改变开发部门编制的程序，即可直接作为量产用测试程序使用。价格为1200万日元以上。